摘 要: 本試驗旨在研究妊娠后期母豬飼糧中添加殼寡糖（COS）對新生仔豬抗氧化能力的影響。選擇體重、胎次和預產期一致的健康“長×白”妊娠母豬16頭，隨機分為2個組，每組8個重復，每個重復1頭母豬。對照組飼喂基礎飼糧，COS組在基礎飼糧中添加30g/t COS。試驗從母豬妊娠85d開始至產仔結束。結果顯示:1) 妊娠后期母豬飼糧中添加COS對母豬繁殖性能沒有顯著的影響(P＞0.05)，但是在一定程度上可以縮短母豬產程。2) 妊娠后期母豬飼糧中添加COS顯著提高了母豬血液中總超氧化物歧化酶(TSOD)活性(P＜0.05)，并有降低血液中丙二醛(MDA)含量的趨勢(P＞0.05)。3) 妊娠后期母豬飼糧中添加COS顯著提高了新生仔豬血液中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性( P＜0.05)，并有降低 MDA含量的趨勢(P＞0.05)。4) 妊娠后期母豬飼糧中添加COS顯著提高了新生仔豬回腸CAT、空腸谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的相對表達量(P＜0.05)。由此可見，妊娠后期母豬飼糧中添加COS縮短了母豬產程，一定程度上能提高母豬及新生仔豬抗氧化能力。
關鍵詞: 殼寡糖；抗氧化；妊娠后期；母豬；仔豬
中圖分類號:S828 文獻標識碼:A
殼寡糖(chito-oligosaccharide，COS )學名為β－1，4－寡聚－葡萄糖胺。COS分子帶有活性氨基基團，而且可被動物直接吸收入血作用于靶細胞在提高機體抗氧化能力方面發揮著重要作，刺激巨噬細胞用。COS可被巨噬細胞內吞 ，刺激巨噬細胞產生多種細胞因子和活性氮氧化物。 金黎明等發現，COS可降低小鼠血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性和肝臟組織中的丙二醛(MDA)含量，保護肝臟不受四氯化碳的損傷，提高肝臟抗氧化力；Liu 等發現，在培養人臍靜脈內皮細胞中添加COS，能增加其超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，抑制過氧化氫生成活性氧。另外，COS可絡合金屬離子，形成重金屬－大分子復合物，抑制由金屬離子催化的氧化性損傷以及羥自由基的產生。
妊娠期動物機體代謝途徑與非妊娠狀態有所不同，這種差異隨妊娠進程表現更為明顯。妊娠后期，胎兒的迅速發育對氧氣與養分需求增加迅速，對母體造成嚴重的代謝負擔，更容易導致氧化應激，而產生的自由基可損傷胎盤絨毛，導致絨毛細胞膜、線粒體膜和胎盤功能異常，影響胎兒在子宮內的發育，此外，應激導致的氧化損傷還會造成母豬泌乳性能和機體免疫機能下降，嚴重影響母豬自身健康、利用年限及其子代發育。因此，抗氧化損傷修復措施的合理選擇對繁殖母豬意義十分突出。本試驗研究通過妊娠后期母豬飼糧中添加COS，以考察COS對母豬及新生仔豬抗氧化能力的影響。
1 材料與方法
1.1試驗材料
COS為水溶性COS，聚合度在2～10之間，以3～4糖為主，分子質量≤2000u，純度為10%，由中泰和(北京)科技發展有限公司提供。
1.2試驗動物與試驗設計
選擇體重接近(185kg左右)、胎次接近(3～5胎)、預產期一致和與配公豬一致的健康“長 ×白”二元雜母豬16頭，隨機分為2組，每組8個重復，每個重復1頭母豬。對照組飼喂的基礎飼糧參照NRC(1998) 推薦的哺乳母豬飼糧營養水平設計配方，基礎飼糧組成及營養水平見表1；COS組在基礎飼糧上添加30g/t的COS(按10% 純度COS折算成純品的添加量)，每天08:30及15:00飼喂2次，每頭母豬投料量在1.8 kg/d左右。試驗從母豬妊娠85d開始至產仔結束，在江西雙胞胎集團贛州安遠金塘原種豬場進行，嚴格按照豬場防疫和飼養管理制度進行操作。
1.3樣品采集及指標檢測
記錄母豬產仔數、健仔數(體重大于800 g)、初生個體重、窩重、產程(首個仔豬產出到胎盤排出的時間間隔)。
妊娠110d前腔靜脈采血10mL，仔豬出生后，于其吃奶前每窩隨機選擇1頭與窩平均體重相近(1.60±0.04)kg的仔豬，前腔靜脈采血5mL，加肝素鈉，輕輕混勻，室溫靜置30 min后離心收集血漿。采用比色法檢測血液中總超氧化物歧化酶(TSOD)、GSH-Px過氧化氫酶(CAT)活性及MDA含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，方法按說明書進行。
將采血后的仔豬屠宰，采集肝臟、十二指腸、空腸、回腸、結腸，以1.5 mL EP管裝好，放入液氮速凍后轉至－80℃冰箱中保存。
1) 預混料為每千克飼糧提供 Premix provided the fol-low ing per kg of the diet:Fe 80 mg，Mn45mg，Zn100 mg，Cu20 mg，I0.70mg，Se 0.25 mg，VA10 000 IU，VD32 500 IU，VE 100IU，VK10 IU，VB210mg，VB61 mg，VB1250μg，生物素 biotin 80μg，葉酸 folic acid 5 mg，氯化膽堿 choline chloride 1 500 mg。
2) 營養水平為計算值。Nutrient levels w ere calculatedvalues．
采用Trizol(Invitrogen 公司，美國)法提取組織中總RNA，具體操作方法參照Simms等，然后將 RNA濃度調節一致，取100ng進行反轉錄，反轉錄試劑盒購自TAKARA公司(日本)，具體方法按說明書進行，再利用Ｒeal-time PCR 法檢測組織中錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD )、銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)基因的相對表達量，基因的引物設計如表2。
1.4 數據處理
試驗數據經 Excel 2010 初步整理后，運用SPSS19.0 統計軟件的 t 檢驗法進行組間差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著，結果以平均值±標準誤（X ± SEM）表示。
2 結果與分析
2.1 妊娠后期母豬飼糧中添加 COS 對母豬繁殖性能的影響，由表3可知，妊娠后期母豬飼糧中添加 COS對母豬繁殖性能沒有顯著的影響( P＞0.05)，但是在一定程度上可以縮短母豬產程。
2.2 妊娠后期母豬飼糧中添加COS對母豬血液抗氧化指標的影響
由表4可知，妊娠后期母豬飼糧中添加COS顯著提高了血液中TSOD活性( P＜0.05) ，并有降低MDA含量的趨勢( P＞0.05)，但對 GSH-Px 及CAT活性無顯著影響( P＞0.05) 。
2.3 妊娠后期母豬飼糧中添加COS對仔豬血液抗氧化指標的影響
由表5可知，妊娠后期母豬飼糧中添加COS顯著提高了新生仔豬血液中GSH-Px、CAT活性( P＜0.05 ) ，并有降低MDA含量的趨勢( P＞0.05)，而新生仔豬血液中TSOD活性差異不顯著( P＞0.05) 。
2.4 仔豬組織中抗氧化基因的表達
由圖1至圖5可知，妊娠后期母豬飼糧中添加COS增加了新生仔豬抗氧化基因 GPX1在十二指腸及結腸中的相對表達量，顯著了降低了GPX1在空腸中的相對表達量( P＜0．05) ；GPX4在空腸中相對表達量顯著上升( P＜0.05) ，且在回腸中的相對表達量有上升趨勢( P＞0.05 )，與血液中GSH-Px 活性的變化一致。Mn-SOD 和CuZn-SOD的相對表達量2組之間均沒有顯著差異 ( P＞0.05 ) ；COS組CAT的相對表達量在回腸中顯著升高( P＜0.05)，且在肝臟中相對表達量有上升的趨勢( P＜0.05)，與新生仔豬血液中CAT活性變化規律一致。
數據注上標* 表示與對照組差異顯著( P＜0.05)。圖5 CAT 在初生仔豬各組織的相對表達量Fig．
3 討論
機體應激過程中產生的自由基具有強氧化性，可損害機體組織與細胞，可使機體內大分子蛋白質氧化生成其他自由基( 如蛋白質－過氧羥自由基) 和蛋白質氧化性產物，如造成蛋白質分子側鏈中氧化性氨基酸的生成、蛋白質片斷化、氨基酸或者蛋白質的亞硝基化以及蛋白質糖基化產物的生成。羥自由基亦可與核苷酸堿基和脫氧核糖鏈直接反應，形成大量修飾化堿基，其中8－羥基鳥嘌呤(8-OHdG) 是堿基主要的損傷形式。另外，自由基與細胞膜系統中的一些不飽和脂肪酸結合，加劇脂質過氧化的發生，生成反應活性很高的醛類( 如MDA)，這些醛類會與核酸、蛋白質等大分子物質交聯聚合，引起基因突變。
COS 是一種具有抗氧化作用的功能性添加劑，研究發現，COS 能減少機體自由基的數量。Sun 等的體外研究表明，COS 對細胞中超氧陰離子有較好的清除作用，其能力甚至與維生素C、SOD的作用相當；另外一些學者發現COS對羥自由基、1，1 － 二苯基 － 2 － 三硝基苯肼 ( DP-PH)PH)［20］自由基亦有較好的清除效果，并且清除作用會隨著COS濃度升高而增強。在本研究中，母豬和仔豬血液中MDA含量均有不同程度下降，而MDA是機體內自由基攻擊細胞膜后脂質過氧化產物，其含量可間接反映出機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，說明妊娠后期母豬飼糧中添攻擊的嚴重程度加COS能減少機體內自由基的產生。
此外，飼糧中添加 COS 具有提高機體抗氧化酶活性的作用，Yoon等通過體外試驗發現，COS 具有緩解急性腎衰竭引起的抗氧化酶活性下降的作用。Liu 等發現，利用 COS 干預由過氧化氫引起的血管內皮細胞抗氧化損傷模型，能有效提高細胞內 SOD、GSH-Px、一氧化氮( NO ) 等抗氧化酶的活性。國內一些學者也發現，COS 能緩解糖尿病、肝損傷模型中抗氧化酶下降的現象，提高機體 SOD、GSH-Px 等抗氧化酶的活性。本研究中，妊娠后期母豬飼糧中添加 COS 使妊娠后期血液中 TSOD 活性上升了17．4% ，MDA 含量下降了 40．6%，證明 COS 對母豬的抗氧化能力具有一定的改善作用。胎兒在母體內通過胎盤與母體進行營養物質、代謝產物、氣體、生物活性物質等的交換，胎盤通過血液循環以滿足胎兒生長發育對營養物質的需要，且胎盤則可以通過形態和功能的變化來適應胎兒對營養物質的不斷需求，因此母體的營養水平及健康狀況直接影響孕期胎兒的發育。在本研究中，妊娠后期母豬飼糧中添加 COS 使新生仔豬血液中 GSH-Px 活性顯著上升，提高了其組織中調控基因 GPX4 相對表達量，然而在仔豬空腸中，COS 組 GPX1 相對表達量出現下降現象，而 GPX4 是物種生存所必需的，被敲除后會導致動物死亡，這說明 GPX4 對個抗氧化系統起到決定性作用，另外，Malandrakis等對金頭鯛的急性應激試驗發現，GPX1 與GPX4 出現相反的表達規律；COS 亦提高了仔豬血液中CAT活性及基因相對表達量；但2個處理之間新生仔豬體內 SOD 活性及基因相對表達量沒有發生明顯的變化。GSH-Px、SOD、CAT 為機體內重要的抗氧化酶，在機體自由基清除上發揮著重要作用，其活性直接反映出機體的抗氧化能力。表明妊娠后期母豬飼糧中添加 COS 可提高新生仔豬抗氧化能力。
4 結 論
妊娠后期 ( 85d 至產仔) 母豬飼糧中添加 30g / tCOS可能通過提高母豬抗氧化酶活性縮短母豬產程，從而影響母豬的繁殖能力；同時，還可提高新生仔豬體內抗氧化酶活性及其上游調控基因的表達，提高仔豬抗氧化力。